• Chọn nguyên liệu:

Các loại DNA sử dụng làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường là DNA plasmid hoặc DNA phage. Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào của vi sinh vật, sau đó sẽ được tách, làm sạch theo phương pháp chiết tách DNA plasmid hoặc DNA virus. DNA chứa gen cần nghiên cứu (DNA lạ) cũng được thu nhận từ tế bào sinh vật được chiết tách, làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách DNA. Ngoài ra, một loại DNA khác có thể sử dụng là DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học, hoặc tổng hợp từ mRNA bằng enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler – Hoffman. Các enzyme để cắt, nối các đoạn DNA lại với nhau gồm enzyme restriction, enzyme ligase, cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase và alkaline phosphotase,…

• Công đoạn cắt với sự tham gia của enzyme RE (Restriction Endonuclease) kiểu II:

RE kiểu II là những enzyme cắt hạn chế ở những vị trí xác lập và được dùng trong công nghệ DNA tái tổng hợp chính do chúng có 1 số ít ưu điểm : phần đông chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí tương thích định trước ngay ở bên trong hay cạnh trình tự nhận ra. Chúng chỉ cần ion Mg và không cần nguồn năng lượng ATP. Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA sẽ cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính. Hiệu quả cắt của enzyme số lượng giới hạn phụ thuộc vào vào nhiều yếu tố khác nhau như hàm lượng của enzyme, nhiệt độ, ion sắt kẽm kim loại, thiên nhiên và môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của DNA .

• Công đoạn nối với sự tham gia của DNA ligase:

Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối những đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo thành plasmid có mang DNA lạ. Phản ứng nối được triển khai bằng cách sử dụng enzyme DNA ligase. DNA ligase là một enzyme xúc tác những phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5 ’ ( P. ) và đầu 3 ’ ( OH ) của hai nucleotide đứng cạnh nhau. Trong sinh học phân tử, DNA ligase được coi như là một chất keo phân tử để kết dính những mẫu DNA lại với nhau. Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tính năng của enzyme ligase, link phosphodiester giữa đầu 5 ’ ( P. ) và đầu 3 ’ ( OH ) được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau. Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp, nên để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ của những đoạn DNA. Với trường hợp nối đầu lệch, hai mảnh DNA đầu lệch do có những base bổ trợ nên chúng tiến gần lại nhau để tạo link hydro giữa những nitrogen base bổ trợ. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu nối tạo link ester giữa OH ( 3 ’ ) và P. ( 5 ’ ) dưới tính năng của enzyme DNA ligase .

Source: https://globalizethis.org/
Category: Hỏi Đáp